早在公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時(shí)，可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認(rèn)識。 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠(yuǎn)鏡的同時(shí)，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當(dāng)時(shí)的光學(xué)工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進(jìn)。 17世紀(jì)中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻(xiàn)。1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動(dòng)和微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺。這些部件經(jīng)過不斷改進(jìn)，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。 1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動(dòng)、植物機(jī)體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出成就。 19世紀(jì)，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)，使顯微鏡觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力大為提高。1827年阿米奇第一個(gè)采用了浸液物鏡。 /&gg].&2?  
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    19世紀(jì)70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。這些都促進(jìn)了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，并為19世紀(jì)后半葉包括科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和微生物提供了有力的工具。 在顯微鏡本身結(jié)構(gòu)發(fā)展的同時(shí)，顯微觀察技術(shù)也在不斷創(chuàng)新：1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。 古典的光學(xué)顯微鏡只是光學(xué)元件和精密機(jī)械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲(chǔ)的接收器。現(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計(jì)算機(jī)后構(gòu)成完整的圖像信息采集和處理系統(tǒng)。 目前全世界最主要的顯微鏡廠家主要有：奧林巴斯、蔡司、徠卡、尼康。國內(nèi)廠家主要有：江南、麥克奧迪等。 :Xw|v2z%3  
    二、顯微鏡的基本光學(xué)原理 E%w^q9C  
    （一） 折射和折射率 光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。當(dāng)與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時(shí)，光線在其介面改變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。    &}DfIP<  
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    （二） 透鏡的性能 透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)和多個(gè)透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負(fù)透鏡)兩大類。 當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱"焦點(diǎn)"，通過交點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱"物方焦點(diǎn)"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點(diǎn)，稱"象方焦點(diǎn)"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。 光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實(shí)像。實(shí)像可在屏幕上顯現(xiàn)出來，而虛像不能。 Xi="gxp$%  
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    （三） 凸透鏡的五種成象規(guī)律 1. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)象； 2. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)象； 3. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象； 4. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則象方不能成象； 5. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。 0i~U(qoI  
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    三、光學(xué)顯微鏡的成象（幾何成象）原理 只有當(dāng)物體對人眼的張角不小于某一值時(shí)，肉眼才能區(qū)別其各個(gè)細(xì)部，該量稱為目視分辨率ε。在最佳條件下，即物體的照度為50~70lx及其對比度較大時(shí)，可達(dá)到1'。為易于觀測，一般將該量加大到2'，并取此為平均目鏡分辨率。 物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關(guān)。有公式y(tǒng)=Lε 距離L不能取得很小，因?yàn)檠劬Φ恼{(diào)節(jié)能力有一定限度，尤其是眼睛在接近調(diào)節(jié)能力的極限范圍工作時(shí)，會(huì)使視力極度疲勞。對于標(biāo)準(zhǔn)(正視)而言，最佳的視距規(guī)定為250mm(明視距離)。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地區(qū)分大小為0.15mm的物體細(xì)節(jié)。 在觀測視角小于1'的物體時(shí)，必須使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測人員近處應(yīng)予放大的物體的。 -y.cy'$f  
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    （一） 放大鏡的成像原理 表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學(xué)透鏡可以使物體放大成像，光路圖如圖1所示。位于物方焦點(diǎn)F以內(nèi)的物AB，其大小為y，它被放大鏡成一大小為y'的虛像A'B'。放大鏡的放大率 Γ=250/f' 式中250--明視距離，單位為mm f'--放大鏡焦距，單位為mm 該放大率是指在250mm的距離內(nèi)用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的比值。 ]B/>=t"E  
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    （二） 顯微鏡的成像原理 顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。 圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計(jì)，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個(gè)倒立的放大的實(shí)像A'B'。 A'B'位于目鏡的物方焦點(diǎn)F2上，或者在很靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。虛像A''B''的位置取決于F2和A'B'之間的距離，可以在無限遠(yuǎn)處（當(dāng)A'B'位于F2上時(shí)），也可以在觀察者的明視距離處（當(dāng)A'B'在圖中焦點(diǎn)F2之右邊時(shí)）。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。 c7mKE`  
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    （三） 顯微鏡的重要光學(xué)技術(shù)參數(shù) 在鏡檢時(shí)，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)，并且要求在使用時(shí)，必須根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿意的鏡檢效果。 顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。 u`|%qRt  
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    1、數(shù)值孔徑 數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。 數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2 孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度�？讖浇窃酱�，進(jìn)入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。 顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率n值�；�于這一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于1，NA值就能大于1。 數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個(gè)數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。 這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值。 數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。 2． 分辨率 顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的最小間距，又稱"鑒別率"。其計(jì)算公式是σ=λ/NA 式中σ為最小分辨距離；λ為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑�？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小σ值，可采取以下措施 J[}H^FR  
    （1） 降低波長λ值，使用短波長光源。 /A9RmTb  
    （2） 增大介質(zhì)n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。 <8WFaP3,  
    （3） 增大孔徑角u值以提高NA值。 5FZw (E  
    （4） 增加明暗反差。 yTZev|ej@  
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    3、放大率和有效放大率 由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應(yīng)該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積： Γ=βΓ1 顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調(diào)換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。 放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。 分辨率和放大倍率是兩個(gè)不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關(guān)系式：500NA<Γ<1000NA 當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時(shí)，顯微鏡不能分清物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)，此時(shí)即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個(gè)輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。 :^7w  
    4、焦深 焦深為焦點(diǎn)深度的簡稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系： B&cIx~+  
    （1） 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔徑成反比。 |k.'w<6mb9  
    （2） 焦深大，分辨率降低。 由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時(shí)造成困難。在顯微照相時(shí)將詳細(xì)介紹。 O3