雙光子顯微鏡（TPM）使研究人員能夠以高分辨率觀察活組織中復(fù)雜的生物過程，從而徹底改變了生物學(xué)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)相比，TPM利用低能光子激發(fā)熒光分子進(jìn)行觀察。反過來，這使得可以更深入地穿透組織，并確保熒光分子或熒光團(tuán)不會被激發(fā)激光永久損壞。

然而，一些生物過程太快而無法記錄，即使使用最先進(jìn)的TPM。限制 TPM 性能的設(shè)計(jì)參數(shù)之一是線路掃描頻率，以每秒幀數(shù) （FPS） 為單位。這是指激發(fā)激光沿一個方向（例如，在水平掃描中）掃描目標(biāo)樣品的速率。緩慢的掃描頻率也會影響系統(tǒng)的整體FPS，因?yàn)樗鼪Q定了激光掃過另一個方向的速度，即垂直掃描。總之，這些在顯微鏡的時間分辨率和觀察框的尺寸之間產(chǎn)生了權(quán)衡。

通過結(jié)合兩種激光掃描模式，研究人員開發(fā)了一種多功能的雙光子顯微鏡系統(tǒng)，可用于以高幀速率和空間分辨率觀察極快的生物過程。

為了解決這個問題，來自中國和德國的一個國際研究小組最近開發(fā)了一種功能強(qiáng)大的TPM設(shè)置，具有前所未有的高線掃描頻率。根據(jù)他們發(fā)表在《神經(jīng)光子學(xué)》上的報(bào)告，這種顯微鏡系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于以高時間和空間分辨率對快速生物過程進(jìn)行成像。

將所提出的TPM與傳統(tǒng)TPM區(qū)分開來的關(guān)鍵因素之一是使用聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來控制激發(fā)激光器的掃描。AOD是一種特殊類型的晶體，其折射率可以通過聲波精確控制。反過來，這使我們能夠根據(jù)需要重定向激光束通過它。更重要的是，與傳統(tǒng)TPM中使用的振鏡相比，AOD可實(shí)現(xiàn)更快的激光轉(zhuǎn)向。

因此，該團(tuán)隊(duì)使用二氧化碲（TeO）設(shè)計(jì)了一種具有極高聲速的定制AOD晶體，實(shí)現(xiàn)高線掃描頻率。使用此AOD，激光器可以在短短2.5微秒內(nèi)掃描幀中的一條線，對應(yīng)于400 kHz的最大線掃描頻率。同樣，該團(tuán)隊(duì)使用AOD在另一個方向上實(shí)現(xiàn)了合理的慢掃描頻率。

為了進(jìn)一步提高顯微鏡的適應(yīng)性，該團(tuán)隊(duì)增加了在必要時切換到基于振鏡的激光掃描機(jī)制的選項(xiàng)。這允許以可接受的分辨率和速度掃描樣品的大區(qū)域，從而在切換到AOD掃描之前更容易找到感興趣的小區(qū)域。

該團(tuán)隊(duì)對新設(shè)計(jì)的TPM進(jìn)行了幾次概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。他們在基因工程小鼠上安裝了顱窗，并用它們來觀察神經(jīng)元的形態(tài)和活動以及單個紅細(xì)胞（RBC）的運(yùn)動。該系統(tǒng)使用適當(dāng)?shù)?nbsp;AOD 配置和幀大小實(shí)現(xiàn)了高達(dá)10,000 FPS 的幀速率。這足以精確測量鈣在神經(jīng)元樹突中傳播的速度，以及可視化血管內(nèi)單個紅細(xì)胞的軌跡。

加州大學(xué)伯克利分校神經(jīng)光子學(xué)副主編兼Luis Alvarez實(shí)驗(yàn)物理學(xué)紀(jì)念主席Na Ji博士對這些結(jié)果印象深刻，他說：“基于AOD的掃描顯微鏡的新系統(tǒng)代表了成像速度和性能的顯著提高，正如其在體內(nèi)鈣信號傳播和血流測量中的應(yīng)用所證明的那樣。

展望未來，新的概念驗(yàn)證TPM設(shè)計(jì)將使捕獲快速生物過程成為可能，并可以顯著提高我們對它們的理解。

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