單顆粒冷凍電鏡技術(shù)是揭示生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的重要手段之一。在樣品制備過程中，均勻薄冰層的制備能夠顯著提高冷凍電鏡成像質(zhì)量，尤其是對于分子量較小的生物大分子（小于100 kDa），因?yàn)楸鶎舆^厚會嚴(yán)重影響信噪比，無法實(shí)現(xiàn)高分辨率結(jié)構(gòu)重構(gòu)。然而，樣品冰層的厚度和均一性難以精確控制，是目前高分辨冷凍電鏡成像的主要挑戰(zhàn)之一。

北京大學(xué)彭海琳教授課題組與清華大學(xué)王宏偉教授課題組，以及北京大學(xué)韋小丁教授課題組合作，揭示了冷凍電鏡樣品支撐膜的表面粗糙度和冰層均一性的關(guān)系，并開發(fā)了超平整石墨烯電鏡載網(wǎng)，解決了均勻薄冰的制備難題。實(shí)驗(yàn)表明，超平整石墨烯支撐膜有助于制備更薄更均勻的玻璃態(tài)冰，背景襯度低，有利于高信噪比和高分辨率的冷凍電鏡成像。使用超平整石墨烯支撐膜，他們對三種分子量較小的蛋白質(zhì)——鏈霉親和素蛋白（52 kDa）、血紅蛋白（64 kDa）和甲胎蛋白（67 kDa）進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，分別得到了2.2Å、3.5Å和2.6Å的高分辨率重構(gòu)。他們還證明該超平整石墨烯載網(wǎng)在冷凍電子斷層掃描重構(gòu)（cryo-ET）等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

研究團(tuán)隊(duì)基于超平整石墨烯單晶晶圓和“面對面”超潔凈無膠轉(zhuǎn)移方法，成功實(shí)現(xiàn)了超平整懸空石墨烯電鏡載網(wǎng)的批量化制備，單層石墨烯懸空膜完整度高達(dá)98%，平均表面粗糙度低至0.7nm。原子力顯微鏡納米壓痕技術(shù)的力學(xué)表征結(jié)果表明，超平整石墨烯支撐膜具有接近于石墨烯理論值的楊氏模量和斷裂強(qiáng)度，遠(yuǎn)高于粗糙起伏的石墨烯支撐膜。

他們將超平整石墨烯載網(wǎng)用于冷凍電鏡成像中，發(fā)現(xiàn)均勻薄冰能顯著提高成像質(zhì)量。一方面，超平整懸空石墨烯的預(yù)應(yīng)力使得冰層在電子束輻照下不易發(fā)生翹曲，有效抑制了樣品顆粒在成像時(shí)的漂移。另一方面，在不同的傾轉(zhuǎn)角度下（-60°至60°），石墨烯表面均無褶皺結(jié)構(gòu)，避免了高角度成像時(shí)褶皺對樣品信號的遮蔽。經(jīng)過測量，利用超平整石墨烯支撐膜所制備的冰層厚度約為20nm，比較均勻，既可有效封裝生物大分子顆粒，也不會過多引入額外的背景噪音。并且，大多數(shù)生物大分子顆粒吸附于石墨烯表面，幾乎處于同一高度，降低了成像時(shí)同一視野下局部欠焦值的差異。與粗糙起伏的石墨烯對比，超平整石墨烯支撐膜保證了高質(zhì)量數(shù)據(jù)的收集，提升了成像效率。

圖1. 懸空石墨烯支撐膜的平整度影響冰層厚度均一性和成像質(zhì)量

圖2.超平整石墨烯載網(wǎng)的設(shè)計(jì)、制備與力學(xué)性質(zhì)表征

圖3. 超平整石墨烯顯著提高冷凍電鏡成像質(zhì)量，成功解析小分子量蛋白的高分辨三維結(jié)構(gòu)

該研究以“超平整石墨烯制備均勻薄冰用于高分辨冷凍電鏡成像”（Uniform thin ice on ultraflat graphene forhigh-resolution cryo-EM）為題，于12月15日發(fā)表在《自然·方法學(xué)》（Nature Methods）。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院彭海琳教授、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉教授和博士后劉楠，以及北京大學(xué)工學(xué)院韋小丁教授為論文共同通訊作者，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士畢業(yè)生鄭黎明、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后劉楠、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院2020級博士生高嘯寅以及北京大學(xué)工學(xué)院博士畢業(yè)生朱文清為論文共同第一作者。

該研究得到國家自然科學(xué)基金、國家重大科學(xué)研究計(jì)劃、北京分子科學(xué)國家研究中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、中國博士后科學(xué)基金、騰訊基金會等的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01693-y